Fluoreszenz

Violette Fluorit-Zwillingskristalle (links) unter kurzwelligem UV-Licht (rechts)

Fluoreszenz ist die spontane Emission von Licht kurz nach der Anregung eines Materials. Dabei ist das emittierte Licht energieärmer als das vorher absorbierte. Fluoreszenz wurde erstmals 1852 von George Gabriel Stokes beschrieben^[1]. Das Wort „Fluoreszenz“ leitet sich von dem fluoreszierenden Mineral Fluorit (Flussspat, Calciumfluorid, CaF₂) ab.

Im Gegensatz zur Phosphoreszenz sind die Übergänge der Fluoreszenz spinerlaubt. Das heißt, sie erfolgen zwischen Zuständen mit gleichem Spin.

Physikalische Systeme bei denen Fluoreszenz auftritt, heißen Fluorophore.

Phosphoreszenz und Fluoreszenz

Sowohl Fluoreszenz als auch Phosphoreszenz sind Formen der Lumineszenz (kaltes Leuchten). Fluoreszenz ist jedoch dadurch gekennzeichnet, dass sie nach dem Ende der Bestrahlung rasch (meist innerhalb einer Millionstel Sekunde) endet. Bei der Phosphoreszenz hingegen kommt es zu einem Nachleuchten, das von Sekundenbruchteilen bis hin zu Stunden dauern kann.

Erklärung

Wird der Fluorophor optisch, also durch die Absorption eines Photons, angeregt, und deaktiviert anschließend unter Aussenden von Licht, so spricht man von Photolumineszenz. Bedingung für die Absorption von elektromagnetischer Strahlung ist die Parallelität des Übergangsdipolmoments des Moleküls mit der Schwingungsebene der elektrischen Feldkomponente des Photons. Je größer der Winkel zwischen diesen beiden, desto unwahrscheinlicher wird die Absorption und damit die Fluoreszenz.

Der angeregte Fluorophor verweilt nach der Absorption eine bestimmte Zeit im angeregten Zustand. Diese Zeit wird im Allgemeinen als Lebensdauer oder im Speziellen auch als Fluoreszenzlebensdauer bezeichnet. Da bei diesem Prozess keine Spinänderung erfolgt, ist diese Lebensdauer in der Regel recht kurz (einige Nanosekunden). Nach dem Verweilen im angeregten Zustand kann die Anregungsenergie sowohl in einem strahlenden Kanal (Fluoreszenz) als auch in einem nichtstrahlenden (z. B. Schwingungsrelaxation) abgegeben werden, woraufhin anschließend der Fluorophor in seinen Grundzustand zurückkehrt.

Bei beiden Kanälen ist zu beachten, dass die Gesamtenergie, die vom System abgegeben wird, aufgrund der Energieerhaltung immer gleich der Anregungsenergie ist. Daraus ergibt sich unmittelbar die Stokessche Regel. Die besagt, dass die Wellenlänge des emittierten Photons in der Regel nie kleiner sein kann, also immer gleich groß oder größer ist als die des absorbierten Photons (größere Wellenlänge heißt weniger Energie). Im Falle von exakt gleichen Wellenlängen spricht man von Resonanzfluoreszenz, ansonsten bewirkt der durch die Schwingungsrelaxation verursachte Energieverlust eine langwellige Verschiebung der emittierten Energie (Stokesverschiebung). Die Wahrscheinlichkeit, mit der die Anregung eines Fluorophors tatsächlich zur Emission eines Fluoreszenzphotons führt, nennt man seine Quantenausbeute.

Deaktivierung

Nichtstrahlende Deaktivierungsprozesse können durch Gegenwart bestimmter Stoffe, sogenannter Quencher, gefördert werden. Das Phänomen, dass durch diese Konkurrenzprozesse die Fluoreszenz vermindert wird, wird als Fluoreszenzlöschung (quenching) bezeichnet. Ein wichtiger Quencher, besonders für die Fluoreszenz organischer Fluorophore, ist Sauerstoff (O₂). Hierauf beruhen Verfahren zur Bestimmung der Stoffkonzentration von Sauerstoff in der Sensorik (Sauerstoffsensor), z. B. zur Überwachung der Sauerstoffkonzentration in der Luft. Die Abhängigkeit der Fluoreszenzquantenausbeute von der Konzentration eines Quenchers wird oft durch die Stern-Volmer-Gleichung gut beschrieben.

In einem alternativen, nichtstrahlenden Prozess kann das angeregte Elektron durch ein sog. intersystem crossing seinen Spin zum in der Regel energetisch tieferliegenden Triplettzustand (Ausnahme: z. B. molekularer Sauerstoff) ändern. Von hier aus sind wiederum beide Deaktivierungskanäle offen, wobei der strahlende, d. h. Licht emittierende, als Phosphoreszenz bezeichnet wird.

Anwendungsgebiete

Im Folgenden sollen einige Methoden und Anwendungsgebiete genannt werden:

Fluoreszenzspektroskopie

Der Begriff der Fluoreszenzspektroskopie fasst Methoden zusammen, die die Fluoreszenzeigenschaften von Fluorophoren ausnutzen, um Informationen über die untersuchten Systeme zu gewinnen. Es gibt viele natürliche und synthetische Verbindungen, die Fluoreszenz zeigen. Mit Hilfe der Spektroskopie lässt sich daher die Zusammensetzung einer Probe ermitteln.

→ Siehe auch: Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie, Fluoreszenzpolarisation, Fluoreszenztomographie, Fluoreszenzmikroskopie.

Aufhellung und Dekoration

Malerei und Objekte aus fluoreszierenden Materialien und UV-Licht des Künstlers Beo Beyond.

Durch die Absorption (unsichtbaren) ultravioletten und blauen Lichts und die Aussendung längerwelligen sichtbaren Lichts lässt sich eine Aufhellung erzielen:

• optische Aufheller
• Signalfarbe (Tagesleuchtfarbe)
• Textmarker (Tagesleuchtfarbe)

Bereits im 19. Jahrhundert wurde über die Fluoreszenz des Aesculins, bzw. sonnenlichtbestahlter, wässriger Auszüge von Rosskastanienrinde berichtet.^[2][3] Diesen Effekt untersuchte der deutsche Chemiker Paul Krais (1866–1939), indem er Wolle und Flachs mit Aesculin-haltigen Extrakten der Rosskastanie versetzte und damit eine optische Aufhellung erzielte.^[4]

In Diskotheken wird oft sogenanntes Schwarzlicht (UV-Licht, UV-A) benutzt, um fluoreszierende Farben, chininhaltige Getränke oder optische Aufheller in Kleidung zum Leuchten zu bringen. Bekannt sind auch Tafeln, die mit fluoreszierender Kreide beschrieben werden können. Sie können von außen oder auch von innen (Flutlicht) durch das transparente Tafelmaterial mit Ultraviolett beleuchtet sein.

Tagesleuchtfarbe fluoresziert bereits durch die Anregung mit dem Blauanteil des Tageslichtes. Da dieser bei schlechtem Wetter und in der Dämmerung besonders hoch ist, wird eine bessere Sichtbarkeit erreicht. Tagesleuchtfarbe gibt es auch in wasserlöslicher Form.

Beleuchtung

Beispiele für Leuchtstofflampen

In Leuchtstofflampen wird ultraviolettes Licht, das durch Gasentladung in der mit Quecksilberdampf gefüllten Röhre erzeugt wird, in sichtbares Licht umgewandelt. In weißen Leuchtdioden (LED) wandeln Fluoreszenzfarbstoffe, die diesen Leuchtstoffen ähnlich sind, das monochromatische blaue Licht, das ein Halbleiterkristall erzeugt, in polychromatisches weißes Licht um.

Technische Fluorophore bestehen aus Stoffen wie dem sehr häufig benutzten Zinksulfid und chemisch ähnlichen Verbindungen oder Oxiden der Selten-Erd-Metalle. Werden diese Verbindungen mit sogenannten Aktivatoren dotiert, lassen sich verschiedene Farben erzeugen. Als Aktivatoren werden häufig zwei- und dreiwertige Lanthanoid-Kationen verwendet. Zweiwertige Europium-Kationen erzeugen beispielsweise blaues Licht, während die dreiwertigen rotes Licht emittieren. Grünes Licht entsteht beispielsweise durch Cu⁺- und Al³⁺-dotiertes Zinksulfid.

Durch geeignete Komposition (Mischung) der Leuchtstoffe lässt sich ein großes Spektrum an nutzbaren Lichtwellenlängen und Farbtemperaturen realisieren, wodurch das Leuchtmittel an den jeweiligen Anwendungsfall angepasst werden kann. In Leuchtstofflampen wird z. B. in Abhängigkeit vom verwendeten Leuchtgas das Spektrum des Sonnenlichtes (kaltweiß) oder das einer Glühlampe nachgeahmt.

Auch Tritiumgaslichtquellen nutzen die Fluoreszenz eines Leuchtstoffes, der durch die Betastrahlung des Tritium angeregt wird.

Anzeigen, Displays und Bildschirme

Vakuum-Fluoreszenzdisplay

Bei Anzeigen, Displays und Bildschirmen wird oft die Anregung der Fluoreszenzfarbstoffe durch Elektronenbeschuss genutzt (Kathodenstrahlröhren). Beispiele sind Vakuum-Fluoreszenzdisplays (Digitron), Kathodenstrahlröhrenbildschirme (englisch Cathode Ray Tube – CRT) und Abstimmanzeigeröhren (Magisches Auge).

Diesen gemeinsam ist die Freisetzung von Elektronen durch Glühemission im Vakuum und deren Beschleunigung auf eine Leuchtstoffschicht durch eine elektrische Spannung. Die zu Demonstrationszwecken dienende Schattenkreuzröhre sowie Feldemissionsmikroskope besitzen dagegen kalte Kathoden, und Bildwandlerröhren beschleunigen die auf einer Photokathode erzeugten Elektronen und erzeugen auf einem kleinen Fluorezenzschirm ein Abbild.

Biochemie und Medizin

Mit Ethidiumbromid gefärbtes Agarose-Gel

An große Biomoleküle kann durch eine chemische Reaktion eine fluoreszierende chemische Gruppe angehängt werden, die dann als sehr sensibler Marker für dieses Molekül dient.

Immunfluoreszenz-Aufnahme im Spinalganglion der Ratte. Zwei verschiedene Proteine wurden mit rot oder grün fluoreszierenden Markern gefärbt.

Strandillustration mittels Bakterienkulturen, die verschiedene fluoreszierende Proteine exprimieren

Anwendungsbeispiele sind:

• Bei der automatischen Sequenzierung der DNA mit der Sanger-Methode hat jede der vier terminierenden Nukleinbasen eines DNA-Stückes ihren spezifischen fluoreszierenden Marker. Wenn die markierten DNA-Moleküle getrennt werden, werden die Marker durch UV-Licht angeregt, und die Identität der Marker wird anhand der Wellenlänge des emittierten Lichtes festgestellt.
• Die Verbindung Ethidiumbromid zeigt kaum Fluoreszenz, wenn sie in einer Lösung ihre Konformation frei ändern kann. Durch Bindung an DNA wird die Fluoreszenz jedoch stark erhöht, was sie nützlich bei der Lokalisierung von DNA-Fragmenten macht, z. B. bei der Agarose-Gelelektrophorese.
• Die Aminosäuren Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin fluoreszieren bei Anregung durch UV-Licht, wobei auch bei Proteinen und Peptiden, die diese Aminosäuren enthalten, Fluoreszenz beobachtet werden kann.
• Auf DNA-Chips und Protein-Chips wird Fluoreszenz für die Detektion verwendet.
• In der Immunologie werden Antikörper mit einer fluoreszierenden chemischen Gruppe versehen, so dass die Orte (z. B. eines mikroskopischen Objektes), an die die Antikörper binden, anhand der Fluoreszenz erkennbar sind. Die Antigen-Konzentration kann damit sogar quantitativ bestimmt werden (siehe Immunhistochemie).
• Die Fluoreszenz von Porphyrinen (Bestandteile bzw. Vorläuferstufen des Häm und Chlorophyll) kann zur Diagnostik von Stoffwechselerkrankungen der Häm-Bildung und die Chlorophyllfluoreszenz zur Bestimmung der Photosyntheseaktivität genutzt werden. Weiterhin dienen Porphyrine zur In-vivo-Diagnostik von epithelialen Tumoren und Präkanzerosen:

• Da Häme in Lebewesen aus Porphyrinen synthetisiert werden, die bei geeigneter Anregung fluoreszieren, sind mittels hochleistungsfähiger chromatographischer Verfahren (HPLC) quantitative Messungen in Blut-, Stuhl- und Urinproben möglich und somit Aussagen über Stoffwechselprozesse bei der Häm-Biosynthese.
• Chlorophyll dient bei der Photosynthese in Organismen zur Umwandlung von Photonen in chemische Energie. Über die Analyse der Chlorophyllfluoreszenz kann man Aussagen zum Zustand des Photosystem II machen und im Rahmen des Umweltschutzes z. B. den Schädigungsgrad von Wäldern untersuchen.
• Die Fluoreszenzdiagnostik (FD) nutzt Protoporphyrin IX (PpIX), das sich selektiv in oder an Tumorzellen anreichert. Die Fluoreszenz von PpIX kann dann in der Dermatologie und Urologie zur Lokalisierung von Tumoren benutzt werden.

• Fluoreszierende Proteine wie das GFP (Green fluorescent protein), YFP oder RFP dienen als Marker bzw. Label für die verschiedensten Moleküle, Proteine und Zellbereiche (Zellmembran, Zytoplasma, Zellkern usw.). Mit geeignenten mikroskopischen Verfahren, wie z. B. der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie, lassen sich damit biologische Vorgänge innerhalb der Zellen sichtbar machen.
• Die abstandsabhängige Aktivierung eines fluoreszierenden Akzeptors nach Fluoreszenzanregung eines benachbarten Donors durch FRET (Fluorescence resonance energy transfer) wird in der Biochemie und der Zellbiologie zu Abstandsmessungen im Nanometerbereich genutzt, sowie zur Untersuchung von Proteinfaltungen.
• Markierung von Proteinen für die differentiellen 2D-PAGE (2D-DIGE)
• FACS (Fluorescent activated cell sorter oder Durchflusscytometrie)
• FISH (Fluorescence in situ hybridization) Chromosomenanalyse
• Beobachtung einzelner Moleküle mittels Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie
• Die Vital-Fluoreszenz-Doppelfärbung dient der Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen.
• TRFIA = time-resolved fluoroimmunoassay. Eu³⁺-Ionen fluoreszieren in Wasser nur kurz. Deshalb verwendet man Chelatbildner, die um die Eu³⁺-Ionen herum eine hydrophobe Umgebung aufbauen. Das führt zu einer längeren Dauer der Fluoreszenz. Dadurch wird eine Unterscheidung von allen anderen, kurzlebigeren Fluoreszenzen möglich, die in organischen Gemischen vorkommen können.

Mineralogie, Gemmologie (Edelsteinkunde) und Forensik

Fluoreszierende Minerale

Mineralien, Schmucksteine, Fasern und viele andere Materialien, die in der Forensik oder an Sammlerstücken und Antiquitäten untersucht werden, haben unterschiedliche Fluoreszenzeigenschaften, wenn sie mit kurz- oder langwelligem UV-Licht oder mit Röntgenstrahlen bestrahlt werden, und können dadurch identifiziert werden.

Kosmische Strahlung

Hochenergetische Kosmische Strahlung löst in der Erdatmosphäre Teilchenkaskaden, sog. ausgedehnte Luftschauer, aus. Die geladenen Teilchen dieser Schauer regen die Stickstoffmoleküle der Luft an, so dass diese Fluoreszenzlicht ausstrahlen. Durch Messungen dieses Lichtes lassen sich Rückschlüsse auf die primäre kosmische Strahlung gewinnen. Ähnliche Phänomene sind das Polarlicht, bei dem die Anregung der Luftmoleküle in erster Linie durch die Teilchen des Sonnenwindes erfolgt, und die Strahlung des leuchtenden Kometenschweifs, bei dem infolge der Wechselwirkung mit dem Sonnenwind Moleküle Licht ausstrahlen.

Biologie und Paläontologie

Euscorpius italicus unter UV-Licht

Die Cuticula der Skorpione fluoresziert bei Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlung. Dabei werden eingelagerte beta-Carboline und 7-Hydroxy-4-methylcoumarin angeregt. Auch nach dem Ableben der Tiere bleibt dieser Effekt erhalten. Mit Hilfe entsprechender Lampen können die Tiere daher bei Dunkelheit leicht entdeckt werden.

Fische, insbesondere kleine, bodengebundene Meeresfische sowie diverse Korallenfische aus verschiedenen Familien (v. a. Gobiidae, Tripterygiidae, Labridae und weitere) haben rot fluoreszierende Muster als Teil der Körperfärbung oder rot fluoreszierende Augen. Dies ist ein Trick, um in tieferem Wasser, in dem blau-grünes Umgebungslicht dominiert, dieses in ein auffälliges rotes Leuchten umzuwandeln. Über die genauen Mechanismen und Funktionen dieser Fluoreszenz ist noch wenig bekannt.^[5]

Haubenfedern von Cacatua sulphurea citrinocristata unter UV-Licht

Auch Vogelfedern können Fluoreszenz zeigen. Einige Papageienvögel besitzen Federn die eine schwefelgelbe Fluoreszenz zeigen. Im Normallicht sind diese Federn (wenn sie nicht von anderen Pigmenten überlagert werden) blassgelb. Das Sehvermögen von Vögeln, die oft tetrachromatischen Augen besitzen, reicht bis in den UV-Bereich. Fluoreszenz bewirkt hier eine Abdunklung des im UV-Bereich reflektierten Lichtes. Unter normalen Lichtverhältnissen ist diese Fluoreszenz zu schwach, um bemerkt zu werden.

Auch in der Paläontologie nutzt man Fluoreszenz zum Auffinden und zur Untersuchung von zahlreichen Fossilien.

Bildende Kunst

Fluoreszierende Farben stellen ein Stilmerkmal in der psychedelischen Kunst dar.

Fluoreszierende Farbstoffe (Auswahl)

Nilrot bei Tageslicht (obere Reihe) und UV-Licht (366 nm, untere Reihe) in verschiedenen Lösungsmitteln.
V.l.n.r.: 1. Wasser, 2. Methanol, 3. Ethanol, 4. Acetonitril, 5. Dimethylformamid, 6. Aceton, 7. Ethylacetat, 8. Dichlormethan, 9. n-Hexan, 10. tert-Butylmethylether, 11. Cyclohexan, 12. Toluol

• Allophycocyanin
• Berberin
• Chinin
• Cumarine
• DAPI
• 1,3,2-Dioxaborine (Komplexe von Borsäurederivaten mit 1,3-Dicarbonylverbindungen)
• Epicocconon
• Fluoresceine
• Fluoreszierende Proteine (GFP, YFP, RFP)
• IAEDANS
• Indocyaningrün
• Natriumdiuranat
• Nilblau / Nilrot
• Porphyrine (Häme, Chlorophylle usw.)
• Quadraine (Quadratsäurefarbstoffe) auf Basis von N,N-Dialkylanilinen
• Rhodamine
• Stilbene
• Synthetische Fluoreszenzlabel bzw. -marker wie z. B. ATTO-Dyes (ATTO-TEC GmbH, Siegen), Alexa-Fluor (Molecular Probes, Invitrogen Corp.) und Cyanine (Cy3, Cy5 usw.)
• TMRM+

weitere Farbstoffe: in der Kategorie Fluoreszenzfarbstoff

Siehe auch

• Parametrische Fluoreszenz
• (Sensibilisierte) Chemolumineszenz

Weblinks

Wiktionary: Fluoreszenz – Bedeutungserklärungen, Wortherkunft, Synonyme, Übersetzungen

• Fluorophores.org – Datenbank für Fluoreszenzfarbstoffe TU Graz
• Fluorescence Spectra Viewer Invitrogen Corp.
• Fluoreszenz. In: Mineralien Lexikon
• Natrium-Resonanzfluoreszenz LP (LehrPortal) der Georg-August-Universität Göttingen
• Lichtmikroskopie und Fluoreszenz Universität Wien
• Fluorescence Microscopy Umfangreiches interaktives Tutorial (engl.)
• Tauchgänge zur Beobachtung der Bio-Fluoreszenz mariner Lebewesen (von Steffen Beyer, englisch und teilw. deutsch)

Einzelnachweise