Zinkfingernukleasen

Zinkfingernukleasen (ZFN) sind künstlich hergestellte Restriktionsenzyme. Sie enthalten eine Zinkfingerdomäne, die an DNA bindet und eine Restriktionsdomäne, welche die DNA schneidet.^[1] Eine Zinkfingerdomäne kann so gebaut werden, dass sie an eine gewünschte DNA-Sequenz bindet. Das bedeutet, dass man mit ZFNs DNA an ganz bestimmten Stellen verdauen kann und somit ein zielgerichteter Einbau von fremder DNA ermöglicht wird. Dies hat den Vorteil, dass man den Ort der Restriktion im Genom genau bestimmen kann - im Gegensatz zu natürlichen Restriktionsenzymen, deren Erkennungssequenz eventuell mehrmals im Genom vorhanden ist, wodurch eine Vorhersage des genauen Einbauortes von fremder DNA nicht möglich ist.

Restriktionsdomäne

Die zufällig schneidende Restriktionsdomäne vom Restriktionsenzym IIs FokI wird häufig in Zinkfingernukleasen eingesetzt^[2]. Diese Restriktionsdomäne ist nur aktiv, wenn sie dimerisiert vorliegt^[3], weswegen zwei unterschiedlich gebaute ZFNs benötigt werden, um eine nicht-palindromische DNA-Sequenz zu schneiden. Bei Standard-ZFNs ist die Restriktionsdomäne über ihr N-terminales Ende und die sequenzerkennende Zinkfingerdomäne (sprich an deren C-terminales Ende) gebunden. Damit die Restriktionsdomänen dimerisieren und schneiden können, müssen die beiden unterschiedlichen ZFNs an den beiden unterschiedlichen Strängen der DNA binden, wobei ihre C-Termini einen bestimmten Abstand zueinander haben müssen.

Mehrere verschiedene Protein-Engineering-Techniken werden verwendet, um die Enzymaktivität und die Erkennungsrate von ZFNs zu steigern. Beispielsweise wurde „Gerichtete Evolution“ angewandt, um eine FokI Variante zu erzeugen, die eine erhöhte Restriktionsaktivität hat^[4]. Auch wurde Strukturelles Designen angewendet, um eine erhöhte Restriktionsspezifität von FokI zu erhalten, indem die Restriktionsaktivität sensibler an die Dimerisierung von zwei FokI-Restriktionsdomänen gebunden wurde und nicht bei einer beliebigen Dimerisierung erfolgt^[5][6][7][8].

Sequenzerkennungsdomäne

Die DNA-Sequenzerkennungsdomäne enthält typischerweise zwischen drei und sechs unterschiedliche Zinkfingermotive, wovon jedes zwischen 9 und 18 bp erkennen kann. Sind die Zinkfingerdomänen perfekt an ihre Erkennungssequenz angepasst, so können schon 3 Zinkfinger ausreichen, die zusammen 18 bp erkennen, um einen einzigen Lokus in einem Säugetiergenom spezifisch zu erkennen. Mehrere verschiedene Strategien wurden entwickelt, um Cys₂His₂ Zinkfinger zu entwickeln, die an die gewünschte Sequenz binden^[9]. Diese Methoden umfassen sowohl das modulare Zusammenbauen (siehe unten), sowie Selektionsstrategien wie das Phagendisplay, das Yeast-1-Hybrid-Systeme, das Bacterial one-hybrid System, das Bacterial two-hybrid System oder zelluläre Selektionssysteme.

Die einfachste Methode neue Zinkfingerarrays zu erzeugen ist die Kombination von Zinkfingern mit bekannter Spezifität. Der am weitesten verbreitete modulare Zusammenbauprozess ist das Kombinieren von drei unterschiedlichen Zinkfingern, die jeweils 3 bp erkennen können, zu einem neuen Zinkfingerarray, das 9 bp erkennt. Der Hauptnachteil dieser Methode ist, dass die Spezifitäten der Zinkfinger je nach benachbartem Zinkfinger und gerade wechselwirkender DNA unterschiedlich sein kann und dann eventuell unbekannt ist. Deshalb muss diese „Kontextabhängigkeit“ berücksichtigt werden.

Einzelnachweise

Weblinks

• Zinkfinger-Nukleasen in der Pflanzenzucht