Silberfärbung

Silberfärbung der Membranproteine von Erythrozyten, die zuvor per SDS-PAGE aufgetrennt wurden.[1]

Die Silberfärbung bezeichnet ein Verfahren zum Anfärben von Proteinen, DNA und RNA in Polyacrylamid-Gelen nach einer Elektrophorese. Das Verfahren basiert auf der Entwicklung von Fotografien. Camillo Golgi verwendete die Silberfärbung unter dem Namen „la reazione nera“ (auf deutsch ‚die schwarze Reaktion‘) zur Kontrastierung des Nervensystems in Gewebeschnitten, später wurde sie auch als Golgi-Methode bekannt.[2][3] Heute werden zur Silberfärbung von Geweben unter anderem noch die Methenamin-basierten Silberfärbungen nach Grocott (bei verschiedenen Pilzen), nach Gomori oder nach Jones (färbt Basalmembranen bei der Diagnostik der Glomerulonephritis) verwendet.

Eine Gomori-Methenamin-Silberfärbung von Leberschnitten mit einer kugelförmigen Schwarzfärbung bei einer Histoplasmose.

Die Silberfärbung von Proteinen in Agarose-Gelen wurde 1973 von Kerenyi and Gallyas entwickelt[4] und seither für Polyacrylamid-Gele optimiert.[5][6][7][8][9][10] Die Glykosylierungen von Glykoproteinen können durch einstündige Vorbehandlung mit einer 0,1 %-Lösung von Periodsäure bei 4 °C oxidiert werden, sodass die Einlagerung von Silberionen verbessert werden kann.[11]

Zunächst werden die Proteine durch eine Fixierlösung aus 10 % Eisessig und 30 % Ethanol im Gel denaturiert und fallen aus, gleichzeitig wird das Detergens (meist SDS) entfernt. Die Diffusion der Proteine ist damit deutlich reduziert. Nach mehrmaligem Waschen mit Wasser wird das Gel in einer Silbernitratlösung inkubiert. Dabei lagern sich Silberionen an negativ geladene Seitenketten der Proteine an. Überschüssiges Silber wird anschließend mit Wasser abgewaschen. Bei dem abschließenden Entwicklungsschritt werden die Silberionen durch Zugabe von alkalischem Formaldehyd zu elementarem Silber reduziert. Dieses färbt die Stellen, an denen Proteine vorhanden sind, schwarz.

Die Intensität der Färbung hängt von der Primärstruktur des Proteins ab. Weiterhin beeinflusst die Sauberkeit der verwendeten Gefäße und die Reinheit der Reagenzien die Silberfärbung.[12]

Diese Methode zeichnet sich durch ihre hohe Sensitivität im Vergleich zu coomassiegefärbten Gelen aus. Die Nachweisgrenze liegt bei 0,1 ng bis 1 ng pro Bande.

Einzelnachweise

  1. Hempelmann E, Götze O: Characterization of membrane proteins by polychromatic silver staining. In: Hoppe Seyler's Z Physiol Chem. 365, 1984, S. 241–242.
  2. Grant G: How the 1906 Nobel Prize in Physiology or Medicine was shared between Golgi and Cajal. In: Brain Res Rev. 55, Nr. 2, Oktober 2007, S. 490–498. doi:10.1016/j.brainresrev.2006.11.004. PMID 17306375.
  3. Golgi C: Sulla struttura della sostanza grigia del cervello.. In: Gazzetta Medica Italiana (Lombardia). 33, 1873, S. 244–246.
  4. Kerenyi L, Gallyas F: Über Probleme der quantitiven Auswertung der mit physikalischer Entwicklung versilberten Agarelektrophoretogramme. In: Clin. Chim. Acta. 47, Nr. 3, 1973, S. 425–436. doi:10.1016/0009-8981(73)90276-3. PMID 4744834.
  5. C. R. Merril, R. C. Switzer, M. L. Van Keuren: Trace polypeptides in cellular extracts and human body fluids detected by two-dimensional electrophoresis and a highly sensitive silver stain. In: Proc Natl Acad Sci U S A. 76(9):4335-9 (1979). PMID 92027.
  6. Switzer RC 3rd, Merril CR, Shifrin S: A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels.. In: Anal Biochem.. 98, Nr. 1, September 1979, S. 231–237. doi:10.1016/0003-2697(79)90732-2. PMID 94518.
  7. H. Blum, H. Beier, H.J. Gross: Improved silver staining of plant protein, RNA & DNA in PAA gels, In: Electrophoresis 8:93-99 (1987)
  8. Rabilloud, T., et al.: Improvement and simplification of low-background silver staining of proteins by using sodium dithionite. In: Electrophoresis 9(6): 288-91 (1988). PMID 2466660.
  9. T. Rabilloud: A comparison between low background silver diammine and silver nitrate protein stains. In: Electrophoresis 13:429-39 (1992). PMID 1425556.
  10. C. Lelong, M. Chevallet, S. Luche, T. Rabilloud: Silver staining of proteins in 2DE gels. In: Methods Mol Biol. 519:339-50 (2009). PMID 19381593.
  11. G. Dubray, G. Bezard: A highly sensitive periodic acid-silver stain for 1,2-diol groups of glycoproteins and polysaccharides in polyacrylamide gels. In: Anal. Biochem. 119(2):325-9 (1982). PMID 6176144.
  12. Hempelmann E, Schulze M, Götze O: Free SH-groups are important for the polychromatic staining of proteins with silver nitrate. In: Neuhof V (ed)Electrophoresis, Verlag Chemie Weinheim. 1984, S. 328–330.

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