Fluoreszenzlöschung
Der Effekt der Fluoreszenzlöschung (engl. Quenching) bezeichnet Vorgänge, die eine Abnahme in der Intensität der Fluoreszenz eines Fluorophors zur Folge haben, ohne dass der Fluorophor zerstört wird. Es existiert eine Reihe von Effekten, die zur Fluoreszenzlöschung führen können, beispielsweise:
- Komplex-Bildung
- interne Konversion
- Energie-Übertragung auf andere Moleküle, sogenannte Quencher
Vom Quenching zu unterscheiden ist die Abnahme der Fluoreszenz aufgrund hoher Anregungsintensitäten oder (meist ungewollter) chemischer Veränderungen des Farbstoffes, wie zum Beispiel durch Oxidation in Anwesenheit von Sauerstoff. Diese Art der Fluoreszenzabnahme bezeichnet man als Ausbleichen des Farbstoffes oder Photobleichung. Der Fluorophor wird dabei irreversibel zerstört. Dagegen ist die Fluoreszenzlöschung eines Fluorophors durch einen Quencher reversibel: Die Fluoreszenz steigt wieder an, sobald der Quencher entfernt wird.
Quenching-Effekte
Zu den Quenching-Effekten gehören alle Vorgänge, die entweder den angeregten Zustand des Fluorophors strahlungslos in den Grundzustand überführen oder aber verhindern, dass der Fluorophor in den angeregten Zustand übergehen kann.
- Dynamisches Quenching
Beim dynamischen Quenching wird die Energie des angeregten Fluorophores durch den Zusammenstoß mit einem Quenchermolekül auf dieses Quenchermolekül übertragen, wobei die Energie letztlich in Wärme übergeht. Diese Art des Quenchings wird auch als Stoßlöschung bezeichnet. Die Verringerung der Fluoreszenz durch dynamisches Quenching kann mit der Stern-Volmer-Gleichung, speziell mit der Stern-Volmer-Gleichung für dynamisches Quenching, beschrieben werden.
- Statisches Quenching
Beim statischen Quenching bilden Fluorophor und Quenchermolekül einen Komplex, dessen Fluoreszenz verringert ist oder ganz ausbleibt. Durch die Komplexbildung wird die Konzentration fluoreszenzfähiger Fluorophore verringert. Die Verringerung der Fluoreszenz durch statisches Quenching kann mit einer Abwandlung der Stern-Volmer-Gleichung, der Stern-Volmer-Gleichung für statisches Quenching, beschrieben werden.
- Resonanz-Energie-Transfer
Beim Resonanz-Energie-Transfer wird die Energie des angeregten Zustandes des Fluorphors D (Donor) strahlungslos durch Resonanzeffekte auf ein zweites Molekül A (Akzeptor) übertragen. Dadurch verringert sich die Fluoreszenz des Fluorophors D. Der Resonanz-Energie-Transfer kann über den Förster-Transfer (FRET) beschrieben werden.
- Mischeffekte
Häufig ist eine Quenchermolekül-Spezies in der Lage, über mehr als einen Effekt den Fluorophor zu quenchen. Es entstehen dann Mischeffekte. Oft treten dynamisches Quenching und statisches Quenching gemeinsam auf. Die Verringerung der Fluoreszenz durch gleichzeitiges dynamisches und statisches Quenching kann durch an Erweiterung der Stern-Volmer-Gleichung für das Mischquenching beschrieben werden.
- Nebeneffekte
Bei der Anregung wird Photonenenergie eingefangen. Beim Quenching wird diese Energie im Material verteilt. Daraus folgt eine Temperaturerhöhung. Durch die Wärmebewegung werden die Absorber auch angeregt und können dadurch strahlen. Das ist eine Konsequenz des Kirchhoffschen Strahlungsgesetzes. Die Abstrahlung entzieht dem Material Energie, das dadurch kühler wird. Meistens können diese Nebeneffekte vernachlässigt werden, aber bei speziellen Vorgängen können diese bedeutsam sein.
Anwendungen
Da die Löschung der Fluoreszenz ein leicht zu beobachtendes und messendes Phänomen ist, bietet sie sich als Indikator für auf molekularer Ebene stattfindende Prozesse an. Ein grundlegendes Prinzip ist dabei, dass durch die An- oder Abwesenheit einer Ziel-Substanz in Lösung ein Fluorophor und sein Quencher einander nahegebracht oder voneinander entfernt werden. In der Grundlagenforschung wird dabei oft die Fluoreszenzlebensdauer gemessen. Die einfachere Alternative, die Fluoreszenzintensität zu messen, ist bei optischen Sensoren häufiger anzutreffen. Beispiele:
- Indikator für Kalium-Ionen
Ein Nachweis für Kalium-Ionen arbeitet mit einem kurzen DNA-Fragment (Telomer-Sequenz), an dessen Enden Farbstoff und Quencher kovalent gebunden sind. In Lösung sind sie voneinander getrennt und der Farbstoff fluoresziert. Wickelt sich das DNA-Fragment jedoch um ein Kalium-Ion, so berühren sie sich und die Fluoreszenz wird gelöscht.
- Indikator für DNA-Hybridisierung
Ein anderer Nachweis nutzt die Tatsache, dass DNA, sobald sie mit ihrem Gegenstrang hybridisiert, eine steifere, lineare Form einnimmt. In dieser Anwendung wird die Löschung beendet, sobald bei Anwesenheit eines korrekt basenpaarenden Gegenstranges, Fluorophor und Quencher, die an den Enden des Stranges angebracht sind, voneinander getrennt werden.
- Indikator für gelösten Sauerstoff
Darüber hinaus existieren Rubidium-Komplexe, bei denen der Grad der Fluoreszenzlöschung ein Maß für die Sauerstoff-Sättigung einer Lösung angibt.