Feld-Fluss-Fraktionierung

Die Feld-Fluss-Fraktionierung (englisch field-flow fractionation^[1]; abgekürzt: FFF) ist eine Technik der analytischen Chemie. Es handelt sich um eine Art der Flüssigchromatographie ähnlich der Gel-Permeations-Chromatographie. Die Trennung findet hier jedoch nicht in Säulen, sondern in Flusskanälen statt. Typische Anwendungen sind die Analyse von Nanopartikeln, Makromolekülen wie synthetischen Polymeren, Biopolymeren (z. B. Polysaccharide) und Proteinen. Vorteil aller FFF-Systeme ist das über die Software frei einstellbare Trennfeld. Somit können verschiedene Proben hintereinander ohne Säulenwechsel vermessen werden. In den FFF-Systemen treten kaum Wechselwirkungen oder Scherkräfte auf; somit sind die Systeme für schwierigste Proben geeignet. Eine der neusten Entwicklungen ist ein Hochtemperatur-FFF-System zur Analyse von Polyethylen. Eine weitere Form der Feldflussfraktionierung ist die Hohlfaser FFF (HF5). Diese wird in der wissenschaftlichen Literatur seit Jahren diskutiert und war immer wieder Gegenstand von Entwicklungsprojekten. Kürzlich erst gelang auf diesem Feld ein technologischer Durchbruch mit dem ersten weltweit verfügbaren HF5-System.^[2]

Historie und Erfindung

Die Technik wurde im Jahr 1966 von John Calvin Giddings (* 1930, † 1996) an der University Utah in Salt Lake City, USA erfunden und patentiert.^[3]

Giddings war ein bekannter amerikanischer Wissenschaftler, der auch im Bereich der Chromatographie forschte. Bekannt wurde er jedoch für seine Arbeiten auf dem Gebiet der Feld-Fluss-Fraktionierung. Er war Gründer des „Field-Flow Fractionation Research Center“ (FFFresearch Center) an der University of Utah. Dort entwickelte und beschrieb er zusammen mit seinen Mitarbeitern und Kollegen in vielfältigen Publikationen die „Theory der Field-Flow Fractionation“ und auch die meisten der bislang bekannten Varianten der Field-Flow Fractionation. Giddings und sein Team entwickelten dort zunächst die Thermal Field-Flow Fractionation (thermische Feld-Fluss-Fraktionierung)^[4] im Jahr 1969, gefolgt von der Sedimentation Field-Flow Fractionation (sedimentations Feld-Fluss-Fraktionierung)^[5] im Jahr 1974, der Flow Field-Flow Fractionation (Fluss-Feld-Fluss-Fraktionierung)^[6] 1976 und schließlich der Split Flow Thin Cell Fractionation (SPLITT) 1985^[7].

Funktionsprinzip

Die Field-Flow Fractionation ist eine Trennmethode bestehend aus unterschiedlichen Subvarianten. Diese FFF-Varianten verwenden alle das gleiche generelle Trennprinzip, jedoch unter Anwendung unterschiedlicher Trennfelder bzw. -kräfte. Je nach eingesetztem Trennfeld, spricht man daher von Flow Field-Flow Fractionation, Sedimentation Field-Flow Fractionation, Thermal Field-Flow Fractionation oder Gravimetric Field-Flow Fractionation. Es gibt auch eine präparative Variante, welche Split Flow Thin Cell Fractionation (SPLITT Field-Flow Fractionation) genannt wird. Insgesamt bietet die FFF-Methode eine schnelle, sehr schonende und hochauflösende Trennung von partikulären Substanzen in flüssigen Medien im Größenbereich von 1 nm bis 100 µm und 1 kDa bis in den Megadalton-Bereich. Dabei läuft die Trennung ohne Säule in einem offenen, flachen und laminar durchströmten Trennkanal ab, der keinerlei stationäre Phase mehr enthält. Aufgrund des parabolischen Strömungsgeschwindigkeitsprofils innerhalb des Kanals, nimmt die absolute Fließgeschwindigkeit von der Kanalober bzw. -unterseite her zum Kanalmittelpunkt hin zu, wobei im Zentrum des Kanals die höchste Strömungsgeschwingkeit herrscht.

Je nach eingesetzter Variante der Field-Flow Fractionation werden unterschiedliche Trennfelder eingesetzt, wie z. B. ein zweiter Flüssigkeitsstrom (Flow FFF), Zentrifugalkräfte (Sedimentation FFF), Temperaturgradienten (Thermal FFF) oder auch nur die Erdgravitation (Gravitational FFF). Diese Trennfelder werden dabei üblicherweise im rechten Winkel zur laminaren Kanalströmung angelegt. Unter dem Einfluss dieser Trennfelder und der entgegengerichteten Eigendiffusion der zu trennenden Teilchen stellt sich ein dynamisches Kräftegleichgewicht ein. Für kleinere Teilchen mit stärkerer Eigendiffusion liegt diese Gleichgewichtslage räumlich höher im Strömungskanal als für größere Teilchen mit geringerer Diffusionskraft. Aufgrund der im Kanal vorherrschenden parabolischen Strömung befinden sich die kleineren Teilchen im zeitlichen Mittel in schnelleren Strömungslinien und werden zeitlich vor den größeren Teilchen aus dem Kanal eluiert. Koppelt man die FFF-Trennung mit Chromatographie-Detektoren, wie z. B. Massenspektrometern, Lichtstreuphotometern, Absorptionsphotometern, Brechungsindexmessung oder Fluoreszenzspektroskopie, werden sogenannte Fraktogramme erhalten, welche ähnlich einem Chromatogramm zu bewerten sind. Die Besonderheit bei einem Fraktogramm ist jedoch, dass die Peaks mit zunehmender Retentionszeit eine zunehmende Partikelgröße bzw. eine zunehmende molare Masse repräsentieren, da die Trennung in der Field-Flow Fractionation größenbasiert abläuft und nicht auf der Wechselwirkung zwischen einer mobilen und einer stationären Phase beruht, wie es bei der Chromatographie der Fall ist.

Aufbau eines FFF-Systems

Die wesentlichen Bestandteile eines FFF-Systems sind ein bis vier Pumpen, Injektionssystem, Trennkanal und verschiedene Detektoren. Die Pumpe saugt das Laufmittel an und erzeugt einen konstanten Fluss durch den Trennkanal, während ein Trennfeld herrscht. Häufig wird das Laufmittel durch einen sogenannten Inline-Degasser gesaugt, der gelöste Gase entfernt. Nach der Pumpe steht das Injektionssystem, entweder manuell oder ein Autosampler. Hier findet die Probe ihren Weg in das System. Im darauf folgenden Trennkanal wird die Probe je nach Trennfeld gemäß ihren Eigenschaften (hydrodynamischer Radius, Molmasse) aufgetrennt. Die verschiedenen Detektoren liefern dann je nach Art bestimmte Aussagen. Letztendlich landet der gesamte Fluss (inklusive Probe) in einem Abfallgefäß. Der Fluss kann aber auch in einzelnen Gefäßen aufgefangen werden. Systeme, die nur eine Pumpe verwenden, sind besonders bedienerfreundlich, weniger störanfällig und wartungsfreundlicher als solche, bei denen mehrere Pumpen zum Einsatz kommen. Bei dieser fortgeschrittenen Technologie werden alle benötigten Flüsse durch die Aufteilung eines einzigen Pumpenflusses generiert und durch ein leistungsfähiges Steuerungssystem geregelt.^[8]

Trennsysteme

Grundsätzlich wird zwischen fünf Systemen unterschieden.^[9]

1. Symmetrischer-Fluss-Feld-Fluss-Fraktionierung (SF4), bei ihr besteht die Ober- und die Unterseite des Kanals aus durchlässigen Fritten durch welche der Querfluss geleitet wird
2. Asymmetrischer-Fluss-Feld-Fluss-Fraktionierung (AF4), bei ihr verwendet man üblicherweise einen Kanal der als obere Begrenzung eine feste undurchlässige Wand besitzt. Wie bei der Symmetrischer-Fluss-Feld-Fluss-Fraktionierung auch, besteht die untere Kanalbegrenzung aus einer porösen Fritte mit einer darauf befindlichen Membran
3. Sedimentations-Feld-Fluss-Fraktionierung (SF3), welche einen rotierenden Ringkanal verwendet, wobei das Trennfeld durch die Zentrifugalkraft erzeugt wird
4. Thermische Feld-Fluss-Fraktionierung (ThFFF), welche die thermische Diffusion zur Erzeugung einer Retention verwendet
5. Hohlfaser-Feldfluss-Fraktionierung (HF5): Hohlfaser aus semipermeablem Material ersetzt den Trennkanal. Hohe Sensitivität bei niedrigen Flussraten und Volumina, daher auch gut mit Massenspektroskopie oder ICP-MS als Detektionsmethode kombinierbar.^[2] Die unter 2. beschriebene AF4 ist die bei weitem am häufigsten angewandte Form der Feldflussfraktionierung, während 1., 3. und 4. eher Nischenanwendungen darstellen.^[10]

Detektoren

Als Detektoren finden Brechzahldetektoren (auch RI-Detektor von engl. refractive index), UV-Detektoren, Infrarot-Detektoren (IR), Viskosimeter und Lichtstreudetektoren Einsatz. Generell unterscheidet man bei den Detektoren die so genannten Konzentrationsdetektoren, deren Signal proportional zur Konzentration ist (RI, UV und IR) von den molekülmassensensitiven Detektoren (Viskosität, Lichtstreuung).

Kalibrierung

Konventionelle Kalibrierung unter Verwendung eines Konzentrationsdetektors: Zur Kalibrierung werden Polymerstandards mit niedrigen Polydispersitäten eingesetzt. Als Ergebnis erhält man relative molare Massen.

Bei Verwendung eines Konzentrationsdetektors in Verbindung mit einem Viskositätsdetekor: Zur Kalibrierung werden Polymerstandards mit niedrigen Polydispersitäten eingesetzt und eine Kalibrationskurve Log (molare Masse × intrinsische Viskosität) aufgestellt. Da das Produkt von (molarer Masse × intrinsische Viskosität) proportional zum hydrodynamischen Radius ist, lassen sich so die relativen bzw. absoluten molaren Massen berechnen.

Lichtstreudetektion

Durch Einsatz eines Lichtstreudetektors entfällt das Aufstellen einer Kalibrationskurve. Der Lichtstreudetektor misst direkt die absoluten molaren Massen. Zur Auswertung ist zusätzlich ein Konzentrationsdetektor notwendig. Die Rayleigh-Gleichung ist die zentrale Gleichung die den Zusammenhang zwischen der gestreuten Lichtintensität, die durch das so genannte Rayleigh-Verhältnis R(θ) ausgedrückt wird, der Polymerkonzentration c und der gewichtsgemittelten Molekülmasse Mw herstellt. Dabei ist K eine optische Konstante und A2 der zweite Virialkoeffizient. Bei der Mehrwinkel-Lichtstreuung wird die Intensität des gestreuten Lichts aus mehreren Winkeln simultan gemessen und anhand der Daten mittels linearer Regression die Molmasse bestimmt. Dadurch wird klar, dass der Messbereich umso größer und die ermittelten Werte umso exakter sind, je mehr Messpunkte, also Winkel, für die Bestimmung herangezogen werden. Dabei ist es wichtig zu erwähnen, dass die Bestimmung der Molmassen absolut erfolgt, d.h. ohne Kalibrierung.oder Bezug zu Standards. Die leistungsfähigsten Geräte arbeiten daher mit bis zu 18 Winkeln.^[11][10] Aber nicht nur die Zahl der eingesetzten Winkel ist wichtig. Entscheidend für die Qualität der Messung ist ebenso das Signal-Rauschverhältnis des Systems. So kann man auch mit 3-Winkel-Geräten sehr präzise Messergebnisse erzielen.

$ {\frac {Kc}{R(\Theta )}}={\frac {1}{M_{w}P(\Theta )}}+2A_{2}c $

Weiterführende Literatur

• A. Zattoni, D. C. Rambaldi, S. Casolari, B. Roda, P. Reschiglian: Tandem hollow-fiber flow field-flow fractionation. In: Journal of chromatography. A [elektronische Veröffentlichung vor dem Druck] März 2011, ISSN 1873-3778. doi:10.1016/j.chroma.2011.02.051. PMID 21419413.
• B. Roda, A. Zattoni, P. Reschiglian, M. H. Moon, M. Mirasoli, E. Michelini, A. Roda: Field-flow fractionation in bioanalysis: A review of recent trends. In: Analytica chimica acta Band 635, Nummer 2, März 2009, S. 132–143, ISSN 1873-4324. doi:10.1016/j.aca.2009.01.015. PMID 19216870. (Review).
• P. Reschiglian, M. H. Moon: Flow field-flow fractionation: a pre-analytical method for proteomics. In: Journal of proteomics Band 71, Nummer 3, August 2008, S. 265–276, ISSN 1874-3919. doi:10.1016/j.jprot.2008.06.002. PMID 18602503. (Review).
• J. Chmelik: Applications of field-flow fractionation in proteomics: presence and future. In: Proteomics Band 7, Nummer 16, August 2007, S. 2719–2728, ISSN 1615-9853. doi:10.1002/pmic.200700113. PMID 17639605. (Review).

Einzelnachweise