Electrophoretic Mobility Shift Assay
Der Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) oder Band Shift Assay dient zum Nachweis von DNA- oder RNA-bindenden Proteinen, beispielsweise Transkriptionsfaktoren. Weitere Möglichkeiten bestehen darin, Protein-Liganden-Interaktionen jeglicher Art zu untersuchen. Dabei werden Proteine mit einem Liganden inkubiert und dann auf dem Gel aufgetragen. Im Vergleich zur reinen Proteinbande tritt ein Shift auf, abhängig von Ladung, Konformation und Größe des Proteinligandenkomplexes. Durch Konzentrationsreihen lassen sich Ks-Werte ermitteln.
Hierbei werden Proteine mit einem DNA-Fragment bekannter Sequenz inkubiert. Bei der DNA-Sequenz handelt es sich meist um einen regulatorischen Bereich eines Gens (beispielsweise eines Promotors oder Enhancers). Die Probe wird auf ein Polyacrylamid-Gel aufgetragen und mittels eines elektrischen Feldes die Komplexe aus Protein, DNA und evtl. Antikörper entsprechend ihrer Größe aufgetrennt. DNA-Protein-Antikörper-Komplexe wandern langsamer als DNA-Protein-Komplexe, freie DNA wandert am schnellsten. Durch Markierung der DNA (beispielsweise radioaktiv oder mittels eines Fluoreszenzfarbstoffs) können die Banden im Gel sichtbar gemacht werden. Je weniger ein Komplex im Gel gewandert ist, desto größer ist seine molare Masse. Hierbei dient zur Spezifizierung der Banden nicht nur die DNA und der Antikörper, sondern es kann auch nicht-markierte DNA in unterschiedlicher Menge zum Blockieren aber auch mutierte DNA zum Herausfiltern eines spezifischen Signals eingesetzt werden.
Enthält die DNA noch einen Antikörper gegen das Protein, wird der Assay mit Supershift bezeichnet.
Weblinks
- Protein/DNA-Interaktionen (englisch)