Taq-Polymerase
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| Taq-Polymerase I | ||
|---|---|---|
| Vorhandene Strukturdaten: s. UniProt | ||
| Masse/Länge Primärstruktur | 835 Aminosäuren | |
| Bezeichner | ||
| Gen-Name(n) | polA | |
| Externe IDs | UniProt: P19821 | |
| Enzymklassifikation | ||
| EC, Kategorie | 2.7.7.7 Nukleotidyltransferase | |
| Substrat | Desoxyribonucleosidtriphosphat + DNAn | |
| Produkte | Diphosphat + DNAn+1 | |
Die Taq-Polymerase ist die thermostabile DNA-Polymerase des Bakteriums Thermus aquaticus (Taq). Dieses Bakterium lebt in Geysiren bei etwa 70 °C. Taq-Polymerase ist außerordentlich hitzebeständig und gehört zu den Extremozymen. Die Ursache hierfür liegt im Vorhandensein eines mutierten Kälteschockproteins, welches sich von vergleichbaren Proteinen mesophiler Bakterien durch den Austausch von zwei Aminosäuren unterscheidet. 1969 wurde die Taq-Polymerase erstmals von Thomas Brock und Hudson Freeze isoliert.[1]
Das Enzym wird hauptsächlich zur DNA-Vervielfältigung mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt. DNA-Polymerasen von mesophilen Organismen würden bei Erhitzung während der Polymerase-Kettenreaktion denaturiert und müssten nach jedem Zyklus neu hinzugegeben werden. Bei der DNA-Vervielfältigung mit Taq-Polymerase ist dies nicht notwendig, da das Enzym auch bei hohen Temperaturen noch sehr stabil ist (die Enzym-Halbwertszeit beträgt bei 97,5 °C ca. 9 Minuten[2]). Die DNA-Amplifikation mit Taq ist jedoch fehleranfällig, denn das Enzym besitzt keine proof reading-Funktion. In den amplifizierten DNA-Fragmenten finden sich deshalb Mutationen, die durch ungenaues Kopieren des Matritzenstranges entstehen. Werden sequenzexakte DNA-Amplifikate benötigt, empfiehlt sich daher der Einsatz anderer Polymerasen, etwa von Pfu- oder Pfx- Polymerasen (die ursprünglich ebenfalls aus thermophilen Mikroorganismen isoliert wurden), deren Einsatz jedoch kostenintensiver ist.
Bei der Amplifikation eines DNA-Fragments hängt die Taq-Polymerase ein zusätzliches Nukleotid (dATP) an das 3'-Ende des synthetisierten Strangs. Man spricht von einem 3'-A-Überhang (A für Adenin), da sich auf dem Matrizenstrang keine komplementäre Nukleobase (Thymin) befindet. Der 3'-Überhang wird durch das Fehlen der proof reading-Funktion nicht korrigiert und findet Anwendung beim Verfahren der TA-Klonierung.
Die Massenproduktion des Enzyms erfolgt durch Übertragung des Gens auf einen Stamm des Bakteriums Escherichia coli. Aus diesen Kulturen wird das Protein gereinigt und in einem glycerolhaltigen Puffer bei −20 °C aufbewahrt.
Einzelnachweise
- ↑ Perl D, Mueller U, Heinemann U, Schmid FX: Two exposed amino acid residues confer thermostability on a cold shock protein. In: Nat. Struct. Biol.. 7, Nr. 5, Mai 2000, S. 380–3. doi:10.1038/75151. PMID 10802734.
- ↑ Lawyer FC, Stoffel S, Saiki RK, et al.: High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity. In: PCR Methods Appl.. 2, Nr. 4, Mai 1993, S. 275–87. PMID 8324500.