iTRAQ
Bei iTRAQ handelt es sich um eine experimentelle Methode aus dem Bereich der Proteinanalytik und Proteomik. Sie dient dazu, verschiedene Proteine und Peptide in einem gemeinsamen Experiment per Massenspektrometrie gemeinsam zu quantifizieren.[1][2][3] Dazu werden die Peptide in den Proben mit verschiedenen Molekülen markiert (genannt Label bzw. Tag). Die Tags besitzen die gleiche Masse, fragmentieren im Massenspektrometer verschieden und können daher im Massenspektrum unterschieden werden. Sie erscheinen dort als einfach geladene sogenannte Reporter-Ionen im unteren Bereich des Spektrums. Dabei handelt es sich um eine gel-freie Methode zur relativen Quantifizierung.
Da die Höhe der Signale (Peaks) im Massenspektrum mit der Abundanz des entsprechenden Ions korreliert, kann über die Peak-Höhe der Reporter das Verhältnis Häufigkeit zueinander gebildet werden, indem die Höhen zueinander in Relation gesetzt werden. Dies ist eine relative Quantifizierung. Ist die Menge einer der Proben bekannt, erlaubt das Verfahren auch die absolute Quantifizierung, da sich die Menge der zweiten Probe über das Verhältnis berechnen lässt.
Die Abkürzung iTRAQ steht für: Isobaric tags for relative and absolute quantitation. iTRAQ findet in der Proteomik Anwendung, unter anderen weil es erlaubt, bis zu vier Proben gleichzeitig zu analysieren – die Weiterentwicklung 8-Plex bis zu acht.
Verfahren
iTRAQ basiert auf dem kovalenten Markieren des N-Terminus und der Amino-Seitenketten der Peptide mit Tags verschiedener Massen. Derzeit werden zwei verschiedene Reagenzien verwendet: 4-plex and 8-plex, welche dazu verwendet werden können, alle Peptide verschiedenster Herkunft zu markieren. Diese Proben werden dann gepoolt und üblicherweise per nano Flüssigchromatografie fraktioniert und anschließend mittels Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) analysiert. Danach wird eine Datenbanksuche mit den Fragmentierungsdaten ausgeführt, um die markierten Peptide zu identifizieren und so die entsprechenden Proteine zu bestimmen. Die Fragmentierung der Tags erzeugt im unteren Massenbereich je Tag-Typ ein Reporter-Ion, dessen Abundanz dazu verwendet werden kann, im gleichen Spektrum die Peptide (und damit die Proteine) relativ zueinander zu quantifizieren.
Datenauswertung
Reporter-Ionen
Die einfach geladenen Reporter-Ionen werden im unteren Spektrum sichtbar bei: 114, 115, 116 und 117.
Peptid-Ebene
Die Signale der Reporter-Ionen in jedem MS/MS-Spektrum erlauben es, die relative Abundanz (Ratio) der Peptide zu berechnen, die über dieses Spektrum identifiziert wurden. Aufgrund von Messungenauigkeiten kann es durchaus auftreten, dass die Reporter-Ionen durch jeweils mehr als ein Signal im Spektrum vertreten sind und diese auf geeignete Weise und ohne Informationsverfälschung zu einem Peak zusammengefasst werden müssen. Hier einfach die Fläche zu integrieren verfälscht das Ergebnis der Quantifizierung ungemein und führt zu gravierenden Fehlern in der Quantifizierung.[4] Die Intensitäten dieser Signale müssen addiert werden, allein deswegen, weil das Instrument selbst schon ein Binning vornimmt und jedes im Detektor erkannte Ion von ihm gezählt wird. Zudem ist ein MS/MS-Spektrum ein Histogramm und repräsentiert keine stetige Kurve, weswegen sich schon allein deswegen die Berechnung einer Fläche verbietet.
Protein-Ebene
Die Ratios der Peptide sind log-normal verteilt.[4] Daher repräsentiert der Median der Peptid-Ratios eines Proteins die relative Quantifizierung dieses Proteins.[4]
Software
Die Daten der MS/MS-Spektren können mit folgender frei verfügbarer Software analysiert werden
- i-Tracker[5], ein einfaches Programm, das um die Peaks eine Trapezfläche konstanter Breite berechnet und diese zur Bestimmung der Ratios verwendet.
- Quant, ein Matlab-Skript, das den statistisch präzisen Algorithmus implementiert[4]
- Quant for windows [6], die Windows-Implementierung von Quant
- jTraqX [7], die portable Java-Implementierung von Quant
Einzelnachweise
- ↑ Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, He F, Jacobson A, Pappin DJ: Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. In: Mol. Cell. Proteomics. 3, Nr. 12, 2004, S. 1154–1169. doi:10.1074/mcp.M400129-MCP200. PMID 15385600.
- ↑ Zieske LR: A perspective on the use of iTRAQ reagent technology for protein complex and profiling studies. In: J. Exp. Bot.. 57, Nr. 7, 2006, S. 1501–1508. doi:10.1093/jxb/erj168. PMID 16574745.
- ↑ Gafken PR, Lampe PD: Methodologies for characterizing phosphoproteins by mass spectrometry. In: Cell Commun. Adhes.. 13, Nr. 5–6, 2006, S. 249–262. doi:10.1080/15419060601077917. PMID 17162667. Volltext bei PMC: 2185548.
- ↑ 4,0 4,1 4,2 4,3 Boehm, A. M., Puetz, S., Altenhofer, D., Sickmann, A., Falk, M., Precise protein quantification based on peptide quantification using iTRAQ, BMC Bioinformatics, 2007, 8: S. 214, doi:10.1186/1471-2105-8-214.
- ↑ Shadforth IP, Dunnley PJ, Lilley KS, Bessant C: i-Tracker: For quantitative proteomics using iTRAQ. In: BMC Genomics. 6, 2005, S. 145. doi:10.1186/1471-2164-6-145. PMID 16242023. Volltext bei PMC: 1276793.
- ↑ Boehm, A. M., Altenhöfer, D., Pütz, S., Precise and Statistically Sound Protein Quantification in Mass Spectrometry Based Proteomics Using iTRAQ, in: Küng, J., Schneider, K., Wagner, R., 2nd International Conference on Bioinformatics Research and Development (BIRD'08), Schriftenreihe Informatik, 26, Trauner Verlag, Linz, 2008: S. 3–12.
- ↑ Muth, T., Keller, D., Puetz, S. M., Martens, L., Sickmann, A., Boehm, A. M., jTraqX: a Free, Platform Independent Tool for Isobaric Tag Quantitation at the Protein Level, Proteomics, 2010, 10(6): S. 1223–1225, doi:10.1002/pmic.200900374.